Olympus IX73 — инвертированный исследовательский микроскоп, широко применяемый в клеточной биологии, эмбриологии и биомедицинских исследованиях. Одним из наиболее востребованных режимов работы на этой платформе является фазовый контраст — метод, позволяющий визуализировать прозрачные живые клетки и неокрашенные биологические объекты без применения красителей, которые могут изменять физиологическое состояние или жизнеспособность клеток. Метод основан на преобразовании разности фаз световых волн, прошедших через объект с различным показателем преломления, в разность амплитуд, воспринимаемую глазом как контрастное изображение.
Корректная настройка фазового контраста на IX73 требует точного соответствия между фазовым кольцом конденсора и фазовой пластиной объектива, правильного выравнивания осветительного тракта по методу Кёлера и точной центровки фазового кольца. Ошибки на любом из этих этапов приводят к характерным артефактам — снижению контраста, появлению паразитных ореолов или неравномерности освещения поля зрения. Настоящая статья последовательно описывает каждый шаг процедуры настройки с учётом конструктивных особенностей платформы IX73.
Алгоритм инсталляции фазовых пластин и конденсора
Подготовка к установке
Перед началом инсталляции компонентов фазового контраста необходимо убедиться в совместимости всех элементов системы. Olympus IX73 использует конденсоры серии IX2-LWUCD (длиннофокусный универсальный конденсор для инвертированных систем) или IX2-UUCD (универсальный ультра-длиннофокусный). Оба варианта оснащены поворотным диском с позициями для фазовых колец, соответствующих различным объективам.
Фазовые кольца в конденсоре IX73 обозначаются индексами Ph1, Ph2 и Ph3, где цифра соответствует числовой апертуре фазового кольца и, соответственно, используемому объективу:
- Ph1 — для объективов с малым увеличением (4×, 10×).
- Ph2 — для объективов среднего увеличения (20×, 40×).
- Ph3 — для объективов с высоким увеличением (60×, 100×).
Каждый объектив с фазовым контрастом маркируется соответствующим индексом (Ph1, Ph2, Ph3) на оправе — это позволяет однозначно установить соответствие между объективом и позицией диска конденсора. Несоответствие фазового кольца и пластины — наиболее распространённая ошибка при настройке, приводящая к полному отсутствию фазового контраста или грубым артефактам.
Установка конденсора
Конденсор на IX73 монтируется в верхней части стойки прибора над предметным столиком. Последовательность установки следующая:
- Освободите посадочное место конденсора, ослабив стопорный винт фиксирующего кольца.
- Аккуратно введите конденсор в посадочное место корпуса вертикально сверху вниз, совместив направляющий штифт конденсора с соответствующим пазом на корпусе — это обеспечивает воспроизводимую ориентацию конденсора при повторных установках.
- Зафиксируйте конденсор стопорным винтом без чрезмерного усилия — достаточно натяжения, исключающего осевое смещение при работе.
- Подключите разъём управления поворотным диском к соответствующему порту на корпусе IX73 — это необходимо для программного управления позицией диска через систему автоматизации, если она используется.
Установка фазовых объективов
Объективы с фазовыми пластинами устанавливаются в стандартные посадочные гнёзда объективного револьвера IX73 стандартным образом. При укомплектовании прибора для фазового контраста рекомендуется установить объективы с фазовыми пластинами на все позиции revolveра, которые планируется использовать в этом режиме, заранее — переключение между Ph1, Ph2 и Ph3 объективами в ходе работы требует соответствующего переключения позиции диска конденсора.
Приобрести Olympus IX73 в комплектации с конденсором для фазового контраста и необходимым набором фазовых объективов, а также получить профессиональную консультацию по оснащению прибора под конкретные задачи можно в компании Микроптика — специализированном поставщике микроскопического и оптического оборудования для научных и медицинских учреждений.
Настройка высоты конденсора
После механической установки конденсора необходимо установить его рабочую высоту. На IX73 высота конденсора регулируется маховиком на корпусе прибора. Правильное положение конденсора по вертикали — критическое условие для корректного формирования изображения в фазовом контрасте.
Начальную установку высоты выполняют по следующему алгоритму:
- Установите объектив с наименьшим увеличением (4× или 10×) и соответствующую позицию конденсора (Ph1 или открытое поле).
- Поместите на столик предметное стекло с любым препаратом или просто стандартное покровное стекло.
- Поднимайте конденсор до положения, при котором его передняя линза оказывается в нескольких миллиметрах от нижней поверхности предметного стекла — для инвертированного микроскопа это расстояние определяется конструкцией конденсора и указывается в технических характеристиках (как правило, 1–3 мм).
- Точную высоту конденсора корректируют позднее — в процессе настройки освещения по Кёлеру.
Специфика регулировки освещения и выравнивания оптических осей
Настройка освещения по методу Кёлера
Освещение по Кёлеру — обязательное условие для корректной работы фазового контраста. Оно обеспечивает равномерное освещение поля зрения и точное формирование конъюгированных плоскостей изображения в оптической системе. На IX73 процедура настройки выполняется в следующей последовательности:
- Установите объектив минимального увеличения (4× или 10×), откройте полевую диафрагму осветителя полностью и откройте апертурную диафрагму конденсора примерно на 70–80% максимального раскрытия.
- Сфокусируйте прибор на поверхность предметного стекла или любой объект в плоскости препарата.
- Закройте полевую диафрагму осветителя до минимального положения — в поле зрения должно появиться резкое изображение края диафрагмы в форме многоугольника.
- Если изображение диафрагмы нечёткое, откорректируйте высоту конденсора маховиком до получения резкого края диафрагмы.
- Если изображение диафрагмы смещено от центра поля зрения, выполните центровку конденсора с помощью центровочных винтов, расположенных на корпусе конденсора. На IX73 конденсор имеет два центровочных винта, расположенных перпендикулярно друг другу, — их поочерёдная регулировка позволяет совместить центр изображения диафрагмы с центром поля зрения.
- После центровки откройте полевую диафрагму до положения, при котором её края едва выходят за пределы видимого поля зрения — это оптимальное рабочее положение.
Центровка фазового кольца
После настройки освещения по Кёлеру выполняется ключевая процедура фазового контраста — точное совмещение изображения фазового кольца конденсора с фазовой пластиной объектива. Для этого необходим вспомогательный окуляр Бертрана (телескоп Бертрана), входящий в комплект IX73 или устанавливаемый в соответствующий порт тубуса.
Последовательность центровки:
- Установите в тубус телескоп Бертрана (или переключите встроенный тубус в режим наблюдения задней фокальной плоскости объектива).
- Переключите диск конденсора в позицию, соответствующую установленному фазовому объективу (Ph1, Ph2 или Ph3).
- В поле зрения телескопа Бертрана будут видны два концентрических кольца: яркое (изображение фазового кольца конденсора) и тёмное (фазовая пластина объектива). Задача — точно совместить эти два кольца.
- Используя центровочные винты диска конденсора, перемещайте изображение фазового кольца до его совпадения с фазовой пластиной. На IX73 центровка диска конденсора выполняется отдельными от центровки самого конденсора винтами, что позволяет выполнять эти процедуры независимо.
- Достигнутое совмещение должно быть концентрическим: оба кольца должны иметь общий центр и одинаковый диаметр без видимого смещения и перекоса.
Регулировка апертурной диафрагмы
После завершения центровки необходимо установить оптимальное раскрытие апертурной диафрагмы конденсора. В режиме фазового контраста апертурная диафрагма не используется как инструмент контрастирования (её роль берёт на себя фазовая пластина), однако её положение влияет на общий световой поток и уровень фонового освещения. Рекомендуемое положение — полностью открытое, если иное не диктуется спецификой конкретного препарата.
Методы проверки результата и устранения артефактов
Критерии корректно настроенного фазового контраста
После выполнения всех процедур настройки качество фазового контраста оценивается по следующим критериям:
- Контраст изображения — неокрашенные клетки или прозрачные структуры должны быть отчётливо видны на светлом фоне с характерным серым тонированием. Хорошо настроенный фазовый контраст обеспечивает видимость ядра, ядрышек, митохондрий (при достаточном увеличении) и клеточных органелл без применения красителей.
- Равномерность фона — поле зрения вне клеток должно быть равномерно освещённым без градиентов яркости и паразитных колец.
- Ореол вокруг объектов — некоторый ореол (halo) является нормальным артефактом фазового контраста, характерным для объектов с высоким градиентом показателя преломления. Чрезмерный или неравномерный ореол свидетельствует о неточной центровке.
Типичные артефакты и их устранение
Слабый или отсутствующий контраст:
- Причина: несоответствие позиции диска конденсора и фазового объектива (например, установлен Ph2 объектив, а диск конденсора в позиции Ph1).
- Устранение: проверьте маркировку объектива и позицию диска, установите соответствующее кольцо.
Неравномерный ореол или асимметричное изображение:
- Причина: неточная центровка фазового кольца конденсора относительно фазовой пластины объектива.
- Устранение: повторите процедуру центровки с телескопом Бертрана, уделив особое внимание точности совмещения колец.
Неравномерность освещения поля (одна сторона ярче другой):
- Причина: смещение конденсора от оптической оси или некорректная настройка освещения по Кёлеру.
- Устранение: повторите центровку конденсора по изображению полевой диафрагмы, убедитесь в правильной высоте конденсора.
Видимые кольца или полосы в поле зрения:
- Причина: пыль или загрязнения на поверхности фазового кольца конденсора или фазовой пластины объектива.
- Устранение: извлеките конденсор, аккуратно протрите поверхность фазового кольца безворсовой оптической салфеткой, смоченной изопропиловым спиртом. Объектив очищайте только с передней линзы, не разбирая его.
Слишком яркий фон, снижающий контраст:
- Причина: чрезмерная яркость осветителя или частично закрытая полевая диафрагма.
- Устранение: снизьте яркость осветителя до комфортного уровня, убедитесь, что полевая диафрагма открыта до рабочего положения (чуть шире поля зрения).
Рекомендации по сохранению параметров для быстрой перенастройки
Протоколирование настроек для каждого объектива
В лабораторной практике IX73 нередко используется несколько объективов с фазовым контрастом в ходе одной рабочей сессии. Переключение между объективами требует соответствующего переключения позиции диска конденсора, однако центровка фазового кольца для каждого объектива — процедура, которую при правильной организации работы достаточно выполнить один раз и зафиксировать результат.
Рекомендуется вести лабораторный журнал настроек, в котором для каждого объектива фиксируются:
- Позиция диска конденсора (Ph1, Ph2 или Ph3).
- Положение центровочных винтов диска (в относительных единицах или с фотографией вида задней фокальной плоскости через телескоп Бертрана).
- Высота конденсора (положение маховика по шкале).
- Оптимальная яркость осветителя для данного объектива.
Современные системы управления IX73 через программный пакет cellSens позволяют сохранять конфигурации прибора в виде именованных пресетов. Каждый пресет включает положение поворотного диска конденсора, яркость осветителя, позицию объективного revolveра и другие управляемые параметры. При наличии моторизованных компонентов переключение между сохранёнными пресетами выполняется одним кликом — без ручных манипуляций с органами управления прибора.
Маркировка физических позиций
Для приборов без полной моторизации рекомендуется нанести маркировку непосредственно на органы управления:
- Отметьте рабочие позиции диска конденсора для каждого объектива цветными точками или наклейками на ободе диска — это исключает ошибку при переключении в ходе работы.
- Нанесите метку на маховик регулировки высоты конденсора в положении, соответствующем корректной рабочей высоте — для быстрого возврата после демонтажа конденсора при чистке или транспортировке.
- Установите ограничители хода на апертурной диафрагме конденсора в положении полного открытия для режима фазового контраста — чтобы исключить непреднамеренное прикрытие диафрагмы при переключении между режимами.
Процедура быстрой верификации настройки
Перед началом каждой рабочей сессии рекомендуется выполнять краткую проверку качества настройки фазового контраста:
- Поместите на столик стандартный тест-препарат или культуральный флакон с клетками известного типа.
- Переключите прибор в режим наблюдения через телескоп Бертрана и визуально оцените концентричность фазовых колец.
- Вернитесь в рабочий режим наблюдения и оцените контраст и равномерность изображения по стандартному образцу.
- Если результат соответствует референсному изображению, зафиксированному при первичной настройке, — прибор готов к работе. При отклонениях выполните коррекцию центровки по описанному выше алгоритму.
Регулярная верификация занимает не более двух-трёх минут и является профилактической мерой, исключающей ситуацию, когда значительный объём данных получен на некорректно настроенном приборе — что может обесценить результаты целого эксперимента.
