Анализ крови на сифилис — реакция Вассермана

Реакция Вассермана (RW) используется уже более 100 лет и доказала свою эффективность в ранней диагностике сифилиса. Эта методика исследования крови достаточно проста, но в то же время очень надежна, что позволяет широко применять ее по всему миру в усовершенствованном виде. Современные активно используемые экспресс-тесты существенно отличаются от классической реакции Вассермана, но в них закладывается основной принцип этой методики, что позволяет часто давать им прежнее название.

Принципиальный подход

По своей сути, реакция Вассермана — это лабораторный анализ кровяной сыворотки, направленный на определение иммунологической реакции организма на проникновение в него возбудителя сифилиса. При заражении сифилисом происходит характерный процесс. Бледная трепонема (Treponema pallidum), содержит антиген кардиолипин. Кровяная сыворотка за счет наличия реагинов вступает в, так называемую, реакцию связывания комплемента (РСК) с образованием специфического комплекса с этим антигеном, т.е. антитела к трепонеме вступают в соединение с трепонемным антигеном.

[youtube]4b5inlagS7Q[/youtube]

Принцип реакции Вассермана основан на выявлении указанной реакции. Если человек заражен сифилисом, то в его крови обязательно появляются антитела к бледной трепонеме, что является физиологическим ответом иммунной системы. Для искусственного провоцирования специфической реакции в кровь вводится препарат, содержащий трепонемный антиген (кардиолипин). Одновременно вводится гемолитическая система для проведения реакции гемолиза, а для сорбции комплексов используется комплемент.

В случае когда возбудитель сифилиса уже проник в человеческий организм, начинается РСК, связывающая антитела в крови с введенным антигеном с образованием специфического комплекса. На эту реакцию расходуется весь вводимый антиген и комплемент. Если антител нет в крови пациента, то кардиолипин вступает в реакцию гемолиза с гемолитической системой, которая полностью его нейтрализует. Проводимый лабораторный анализ выявляет комплексы антитело-антиген, которые обнаруживаются визуально. Концентрация комплексов показывает интенсивность их образования и условно оценивается по количеству знаков (плюс): от (+) до (++++). Исследования на RW можно проводить на кровяной сыворотке или спинномозговой жидкости.

Реакционный состав

Для обеспечения RW в кровь исследуемого человека вводится специальная смесь, которая содержит 3 основных ингредиента: антиген, комплемент и гемолитическую систему. Главную реакцию Вассермана обеспечивает антиген, представляющий собой искусственно приготовленный антиген возбудителя. Он может готовиться в 2 вариантах: обработанная ультразвуком культура бледной трепонемы или кардиолипин, получаемый из бычьего сердца. Чаще всего используется второй вариант, когда препарат приготавливается путем тщательной очистки спиртового липидного экстракта, получаемого из мышечных тканей бычьего сердца. Для повышения активности антигена добавляют фосфолипид, лецитин и холестерин. Необходимая доза антигена обеспечивается разведением его в растворе хлорида натрия.

Гемолитическая система соединяет в себе гемолитическую сыворотку (гемолизин) и эритроциты из крови барана. Сыворотку получают из крови кроликов и ослов, а затем ее иммунизируют эритроцитами барана. Эритроциты выделяются из крови барана в возрасте 1-4 года, а забирается она из яремной вены. Комплемент приготавливается из кровяной сыворотки, получаемой из сердца морских свинок. Для проведения RW указанные ингредиенты берутся в равном количестве — по 0,25 или 0,5 мл.

Как проводится анализ крови

Кровь у пациента на анализ берется натощак или через 7-8 часов после приема пищи. Нельзя брать пробы в следующих обстоятельствах: повышенная температура тела, после недавно перенесенной болезни инфекционного характера, во время месячных у женщин, за 12-15 дней до родов у беременных женщин, сразу после родов, в течение суток после приема алкоголя. Не следует брать анализ у новорожденных детей в первые 2 недели жизни.

Кровь для проведения исследований отбирается из локтевой вены в объеме порядка 9-10 мл с соблюдением всех антисептических правил. У младенцев кровь берется путем надреза пятки специальным скальпелем. На проведение реакции проба должна поступить в течение 2 суток после отбора крови и при условии хранения при температуре не выше 3-4ºС.

Из крови пациента приготавливается сыворотка в следующем порядке. Кровь выдерживается при температуре 37ºС в термостате в течение 18-28 минут, а образовавшийся кровяной сгусток отделяется и поступает на центрифугу, где обрабатывается на скорости порядка 1000 об/мин в течение 14-16 минут. После такой процедуры над сгустком появляется прозрачная кровяная сыворотка, которая и забирается для дальнейших исследований. Если в сыворотке обнаруживаются эритроциты, то проводится повторное центрифугирование для их отделения. Окончательно выделенная сыворотка проходит инактивацию при 55-57ºС в течение 28-35 минут. Таким образом удаляется натуральный комплемент и нормализуется состояние глобулинов. Полностью подготовленная кровь хранится в холодильнике не более 7 дней.

Определение реакции Вассермана кровяной сыворотки осуществляется в 3 пробирках: во все пробирки наливается сыворотка, разведенная раствором хлорида натрия в пропорции 1:5, а затем в первую пробирку вводится 0,25 мл трепонемного антигена, во вторую — 0,25 мл кардиолипина, а в третью (контрольную) — 0,25 мл раствора хлорида натрия. Затем во все пробы вводится такое же количество комплемента. Необходимо отметить, что смешивание компонентов заранее не производится.

Следующий этап — первичная инкубация в термостате при температуре 36-38ºС в течение 46-55 минут. После тепловой обработки вводится гемолитический состав (по 0,5 мл в каждую пробирку) с перемешиванием путем встряхивания. Далее осуществляется окончательная инкубация в аналогичных условиях до полного завершения операции гемолиза. Внимательно оценивается наличие или отсутствие гемолиза. Оценку результатов реакции проводят путем сравнения с контрольными образцами. Для этой цели используется 2 дополнительные пробирки: в одну помещается кровь, в которой достоверно установлен возбудитель сифилиса, а в другую — кровь абсолютно здорового человека.

Исследование спинномозговой жидкости

Антитела к бледной трепонемы могут располагаться в спинномозговой жидкости, поэтому иногда исследования на реакцию Вассермана проводятся на пробах этой жидкости. Пробы исследуются одновременно в 3 вариантах: неразведенная спинномозговая жидкость, разведенная в соотношении 1:2 с раствором хлорида натрия и разведенная с тем же раствором в пропорции 1:5. Реакцию проводят аналогично с исследованием кровяных проб, т.е. с трепонемным антигеном и кардиолипином. Комплемент вводится по специальным титрам. Сама методика проведения реакции и оценка исследования спинномозговой жидкости не отличается от исследования на кровяной сыворотке.

Как оцениваются результаты

Нормой или отрицательным результатом реакции Вассермана (отсутствие заражения сифилисом) считается протекание реакции гемолиза. В этом случае в крови отсутствуют антитела к сифилитическому возбудителю, а все введенные антигены нейтрализуются гемолитической системой.

Положительный результат, т.е. наличие заражения, оценивается путем сравнительного анализа с контрольными образцами. Степень тяжести болезни или ее стадия обозначается количеством знаков «плюс»:

• (+) или (1+): небольшая задержка гемолиза;
• (++) или (2+): слабо положительная реакция или частичная задержка гемолиза;
• (+++) или (3+): положительная реакция или значительная задержка гемолиза;
• (++++) или (4+): резко положительная реакция или полное отсутствие гемолиза.

Кроме того, существует такое понятие, как сомнительная реакция, обозначающаяся в виде (+/-). Такая реакция требует перепроверки и уточнения. При проведении оценки реакции Вассермана следует учитывать такой факт: у 4-6% здоровых людей наблюдается ложноположительный результат, а у зараженных людей (до 25%) может наблюдаться ложноотрицательный результат в течение 14-18 суток после инфицирования бледной трепонемой. Ложноотрицательные результаты меняются по мере развития болезни: после 4-6 недель болезни до 26% результатов становятся положительными, а к 8-9 неделе почти все они дают положительную реакцию.

Отрицательный результат в скрытом периоде второй фазы сифилиса не всегда свидетельствует об отсутствии болезни. При рецидиве сифилиса реакция становится положительной. После проведения лечебного курса отрицательный результат указывает только на благоприятную тенденцию, но требует перепроверки. Другая проблема оценки эффективности лечения — появление синдрома, так называемого серорезистентного сифилиса, когда после излечения реакция Вассермана все равно дает отрицательный результат.

Реакция Вассермана в большинстве случаев достаточно четко выявляет заражение сифилисом, однако в ряде случаев отрицательная реакция не дает гарантии отсутствия инфекции, также как и положительный результат может появиться и при отсутствии сифилиса.

В частности, ложноположительная реакция может возникнуть в следующих случаях:

• прием алкоголя;
• беременность;
• болезни соединительных тканей системного характера;
• пневмония;
• туберкулез;
• онкология;
• осложненные печеночные патологии;
• сахарный диабет;
• скарлатина;
• брюшной тиф;
• инвазии паразитов;
• малярия;
• лептоспироз;
• месячные у женщин.

Ложный результат может проявиться даже при употреблении жирной пищи непосредственно перед исследованиями.

[youtube]Vb3MUM4x9r4[/youtube]

Результаты реакции Вассермана нельзя расценивать как истину в последней инстанции. Они, скорее, дают импульс для проведения дополнительных обследований. Для этих целей в настоящее время применяются различные трепонемные тесты. К современным методикам экспресс-диагностики сифилиса относятся усовершенствованные аналоги реакции Вассермана: тест RPR, который дополняется трепонемными тестами РПГА.

Реакция Вассермана сыграла огромную роль в развитии диагностирования сифилиса на ранних стадиях. Однако ее результаты не всегда однозначно оценивают наличие болезни, в связи с чем в настоящее время применяются более совершенные способы, принцип функционирования которых взят из классической реакции Вассермана. Исследования данного типа, в основном, продолжают использоваться при контроле лечебного процесса, но могут применяться и для выявления сифилиса.